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细胞内高通量筛选雄激素受体配体

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-01-12  来源:美中药源(微信号 meizhongyaoyuan)
 
 


新闻事件

这一期的《Scientific Report》发表了一个阿斯列康科学家通过细胞内TSA(CETSA)筛选雄激素受体(AR)拮抗剂的工作(doi:10.1038/s41598-017-18650-x)。这个工作用一个AR激动剂(DHT)饱和AR,从而增加AR的热稳定性。然后筛选了一个包括已知AR拮抗剂的化合物库,AR拮抗剂因为和DHT竞争结合位点令AR热稳定性下降。这个筛选可以区分、排序已知的AR拮抗剂,并可以区分间接AR调控剂(虽然影响AR信号但不是直接和AR结合)。因为这个测试是与DHT的竞争,所以也第一次在细胞内复杂环境测量了AR拮抗剂的抑制常数(Ki)。

药源解析

AR是前列腺癌的重要诱因,雄激素合成抑制剂Zytiga去年在早期前列腺癌患者中降低38%死亡,成为ASCO重磅。Xtandi是AR直接拮抗剂,也是重磅药物,去年被辉瑞收购。有望成为第一个进入临床的PROTAC药物ARV-110也是降解AR。可见AR依然是个非常重要的靶点。

通常化合物的靶点活性是通过纯化蛋白系统测量,但这个系统一般在缓冲液里,与真正的细胞内环境相差很大。细胞内有大量与小分子化合物结合的蛋白,降低药物有效浓度。化合物即使能进入细胞也也不一定能有效进入靶点所在的小区,所以活性好未必能见到靶点。另外因为技术原因纯化蛋白经常不是整个蛋白,而是其中一段,片段蛋白与小分子配体结合力可能与整个蛋白不同。最后蛋白在细胞内可能与其它蛋白形成复合物才有活性,这个性质在纯化系统中也不存在。这类似学英语时带耳机听标准英语与在酒吧嘈杂的环境里与有口音美国人交流的区别。

所以很多在纯化系统活性很高的化合物在真正的细胞内活性并不好,造成出现PK-PD失联。而细胞内的靶点结合能力并不容易测量,通常细胞试验都是间接测量目标靶点活性,不能区分靶点活性和通路活性。这个可能增加开发风险,因为靶点一般通过基因学实验确证,只有直接与目标蛋白结合才最可能重复基因学数据。抑制通路上其它蛋白虽然可以改变目标参数,但不一定能完全与抑制目标蛋白功能一致。

近年来出现几个直接策略细胞内与靶点结合的技术,CETSA是其中之一。这个技术不需要标记蛋白、也不需要标记化合物,所以比较容易操作。蛋白与配体结合后通常热稳定会增加,所以通过加热被化合物处理过的细胞、追踪目标蛋白的变性温度与化合物浓度关系可以测量化合物在细胞内与目标蛋白直接结合的能力。这个实验与一般CETSA还有所不同,因为作者发现AR拮抗剂与AR结合并不改变变性温度,但激动剂DHT则可增加热稳定性。拮抗剂可以取代DHT因此把AR热稳定恢复到游离AR水平。这个工作说明CETSA可以作为高通量筛选平台。理论上CETSA也可同时跟踪不同蛋白而测定化合物在细胞内复杂环境下的选择性,这可能是对小分子药物研发更重要的工作。

 
 
 
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